Экспрессия и коэкспрессия онкобелков

Экспрессия и коэкспрессия онкобелков

Коэкспрессия

Физико-химическая биология

Клиническая медицина

Профилактическая медицина

Медико-биологические науки

АРХИВ:

Фундаментальные исследования

Организация здравохраниения

История медицины и биологии

Последние публикации

Поиск публикаций

Архив : 2000 г. 2001 г. 2002 г.
2003 г. 2004 г. 2005 г.
2006 г. 2007 г. 2008 г.
2009 г. 2010 г. 2011 г.
2012 г. 2013 г. 2014 г.
2015 г. 2016 г. 2017 г.
2018 г. 2019 г. 2020 г.

Редакционная информация:
Опубликовать статью

  • Список членов редколлегии

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
«Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства»
(ФГБУН ИТ ФМБА России)

Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

199406, Санкт-Петербург, ул.Гаванская, д. 49, корп.2

ТОМ 4, СТ. 131 (стр. 465-470) //

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЯ. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ДАННЫХ

Е.Е.Зуева *
Санкт-Петербургский Медицинский Университет им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Российская Федерация

Резюме
Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга человека традиционно осуществляется методом проточной цитометрии и позволяет оценивать экспрессию нескольких маркеров одновременно. Использование многоцветного окрашивания требует корректной оценки получаемого изображения. Рассмотрены варианты коэкспрессии маркеров при проведении трехцветного окрашивания. Показана возможность оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции при анализе изображения в пространстве двумерной гистограммы.

Ключевые слова: иммунофенотипирование, проточная цитометрия, анализ изображения

Определение фенотипа клеток — как циркулирующих в крови, так и входящих в состав сложных тканей, на сегодняшний день не составляет особого труда. Для этого используют способность клеток связываться со специфическими антителами. Так как антитела могут быть получены практически к любому белку (или его фрагменту) с установленной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью соответствующей ДНК, то и иммунофенотипирование (ИФТ) может быть использовано практически в любых областях биологии и медицины 1 . В любом случае для визуализации целевых молекул используют антитела, меченные ферментами, металлами или флюорохромами. Проточная цитометрия (ПЦ), использующая в качестве метки моноклональных антител такие стабильные флюорохромы как флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), фикоэритрин (ФЭ), перидинин-хлорофилл протеин (Per CP) и др., обладает практически неограниченными возможностями по оценке клетки и ее компонентов. Выявление флюоресценции каждого из этих флюорохромов и усиление светового сигнала на фотоумножителях проточного цитометра позволяет одновременно получать информацию о физических параметрах клетки (размер и гранулярность) и о наличии/отсутствии экспрессии тех или иных антигенов (маркеров) 2 . Развитие технологий достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ золотым стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток 3 . Анализ коэкспрессии маркеров позволяет определять субпопуляционную принадлежность лимфоцитов и выявлять опухолевые клетки в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга.

Пробоподготовка
Стандартная пробоподготовка для выявления поверхностных маркеров клеток периферической крови и костного мозга осуществляется по протоколам окрашивание-лизис-отмывка и окрашивание-лизис-без-отмывки 4 . При необходимости отсрочить анализ на 2-24 часа пробоподготовка может быть дополнена фиксацией клеток образца. При необходимости выявления внутриклеточных маркеров в протокол окрашивания должна быть включена процедура пермеабилизации 5 . При работе с клеточной суспензией, в которой по определению отсутствуют эритроциты (например, ликвор или суспензия мононуклеаров, полученная в результате градиентного центрифугирования) из протокола пробоподготовки может быть исключена процедура лизиса.

Учет результатов
Анализ антигенной экспрессии осуществляется на проточном цитометре с использованием программного обеспечения для анализа больших массивов данных. Возбуждение флюоресценции происходит при прохождении клеткой фокального пятна аргонового лазера, охлаждаемого воздухом (мощность 15 mW, испускаемая длина волны 488 нм). Учет флюоресценции осуществляется при 512-547 нм, 572-591 нм и более 610 нм для FITC, PE и PerCP/PE-Cy5 каналов флюоресценции на первом (FL1), втором (FL2) и третьем (FL3) фотоумножителях соответственно. Таким образом, получают данные по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию, а также по флюоресценции клеток, связавших флюорохром-конъюгированные антитела. Компенсация наложения флюоресценции осуществляется средствами программного обеспечения. Позитивность окрашивания с любым антителом оценивается при наложении квадрантов, определенных отрицательным изотипическим контролем.

Представление данных
Данные по прямому и боковому светорассеянию исследуемых клеток отражают на двумерных гистограммах FSC/SSC (прямое forward side scatter (FSC) и угловое side scatter (SSC) светорассеяние). Для сигнала по FSC и SSC обычно используют линейное усиление, сигналы флюоресценции могут быть усилены до четырех (пяти) декадной логарифмической шкалы. Логическое ограничение лимфоцитарного гейта определяется по нижнему и верхнему значению лимфоцитарного пика на одномерной гистограмме и применяется к двумерным гистограммам. Моноцитарный гейт касается лимфоцитарного гейта с превышением значения SSC в полтора раза. Гранулоцитарный гейт касается моноцитарного гейта и распространяется вверх по всей оси SSC. Левая и правая границы моноцитарного и гранулоцитарного кластеров определены по соответствующим пикам на одномерных гистограммах. При использовании одноцветного анализа с различными флюорохромами сигналы фотоумножителей FL1, FL2 и FL3 отражены на одномерных четырехдекадных гистограммах. При использовании многоцветного анализа данные по каналам флюоресценции отражены на двумерных четырех декадных log/log гистограммах (FL1/ FL2, FL2/ FL3 и FL3/ FL1). Квадранты в этих гистограммах (FL1/ FL2 (FITC/PE), FL2/ FL3 (PE/PerCP) и FL3/ FL1 (PerCP/FITC)) определяют две разделительные линии, фиксированные для всех измерений на одной четверти шкалы флюоресценции по абсциссе и ординате. Для анализа малоклеточных популяций могут быть также использованы смешанные линейно-логарифимированные гистограммы SSC/FL(1-3).

Читайте также:  Акушер-гинеколог рассказал, до какого возраста можно рожать и как не бояться родов

Анализ данных
Анализ данных заключается в определении положения кластера клеток в многомерном пространстве проточной цитометрии. При выявлении на двумерной гистограмме Fl2/Fl1 кластера событий, позитивного по обоим маркерам, использование трехцветной метки позволяет получить четыре варианта экспрессии третьего маркера (рис.1.)


Варианты экспрессии третьего маркера на популяции клеток, позитивной по двум маркерам. На гистограмме экспрессии антигенов 1 и 2 (Аг1 и Аг2) выявлен кластер событий, позитивный по обоим антигенам (А). Внутри этого кластера экспрессия антигена 3 (Аг3) может отсутствовать (кластеры Б и В), либо быть выражена (присутствовать) (кластеры Г и Д). Таким образом, получена возможность выявить внутри кластера А четыре варианта сочетаний экспрессии маркеров: Аг1 + Аг3 — (Б), Аг2 + Аг3 — (В), Аг1 + Аг3 + (Г) и Аг2 + Аг3 + (Д).

При одновременном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций (табл1),

Фотоумножитель Регистрация сигнала флюорохрома Обозначение кластера на гистограмме
Fl1 Fl2 Fl3
Fl1 А
+ Б
Fl2 + В
+ + Г
Fl3 + Д
+ + Е
+ + Ж
+ + + З

расположение которых в пространстве трех четырехдекадных гистограмм (FL1/Fl2, Fl2/Fl3, Fl3/Fl1) строго определено (рис.2).


Варианты сочетанной экспрессии (бинарный вариант). Варианты сочетанной экспрессии маркеров при трехцветном окрашивании. При совместном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций в пространстве трех двумерных гистограмм. Буквенные обозначения аналогичны табл. 1.

Такое изображение может быть получено при гомогенном характере экспрессии, т.е. в том случае, если все клетки популяции однородно экспрессируют каждый анализируемый маркер.

Анализ коэкспрессии маркеров
Далеко не во всех случаях, популяция, позитивная по экспрессии одного маркера, также однородно экспрессирует другой маркер. Для оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции может быть использована схема изображения возможных вариантов коэкспрессии в пространстве двумерной гистограммы (рис.3).

Типы коэкспрессии антигенов. На гистограмме А представлена однородная экспрессия Аг2 и неоднородная коэкспрессия Аг1 клетками анализируемой популяции. На гистограмме Б представлен обратный вариант однородной экспрессии Аг1, при котором неоднородным образом коэкспрессируется Аг2. На гистограмме В вяывлено две популяции: популяция Аг1+Аг2- и Аг2+ популяция, обладающая гетерогенной экспрессией Аг1+. На следующих двух гистограммах изображены популяции, позитивные по одному исследуемому маркеру и негативные по другому: на гистограмме Г — популяции Аг1-Аг2+ и Аг1+Аг2+, на гистограмме Д — популяции Аг1+Аг2- и Аг1+Аг2+. При получении результата, изображенного на гистограмме Е, корректная интерпретация данных затруднена в связи с высоким уровнем аутофлюоресценции Аг1-Аг2- и наличием мертвых клеток, которые неспецифически, в равных количествах, связывают маркеры обоих антигенов. Количественное совпадение относительного содержания популяций с одинаковым суммарным фенотипом, выявленных на различных гистограммах, является внутренним контролем качества пробоподготовки.

Фактически на двумерной гистограмме может быть представлено всего несколько вариантов коэкспрессии маркеров.

Заключение
Мультипараметрический анализ данных ПЦ основан на анализе изображения, отражающего гомогенный или гетерогенный характер экспрессии маркера (маркеров) изучаемой популяции. Процесс обработки данных может быть автоматизирован и стандартизован, однако далеко не все биологические образцы удовлетворяют условиям автоматической обработки изображения 6 . Следовательно, сохраняется роль эксперта, сопоставляющего данные ИФТ с морфологией и клинической картиной заболевания. Отрицательные результаты ПЦ также должны соответствовать результатам других исследований. Таким образом, максимальная точность в диагностике достигается при сочетанном использовании автоматизированного анализа изображения и экспертной оценки биологического образца и позволяет точно ответить на простой вопрос пациента: «Я болею лейкозом?»

* Адрес для переписки: Зуева Екатерина Евгеньевна, с.н.с. лаборатории молекулярной диагностики Научно-методического центра по молекулярной медицине СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова, ул. Л.Толстого, 6/8, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197089. Тел/факс: +7 812-2387194, e-mail: dinzu@mail.ru

1 Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. С.Херрингтона и Дж. Магки, М.,Мир, 1999, 506 стр.

2 Horsburg T., S. Martin, A.J.Robson The application of flow cytometry to histocompatibility testing. Transplant Immunology 2000, 8 (1):3-15.

3 Gelman R., Wilkening C. Analyses of quality assessment studies using CD45 for gating lymphocytes for CD3+CD4+%. Cytometry (Comm in Clin Cytometry) 2000; 42:1-4.

4 Gratama JW, Sutherland DR, Keeney M, Papa S. Flow cytometric enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells. J Biol Regul Homeost Agents 2001;15:14-22.

5 Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting enotype of acute leukemias. Leukemia 2002; 16:1233-1258.

6 Cualing HD. Automated analysis in flow cytometry. Cytometry. 2000 Apr 15;42(2):110-3

Коэкспрессия онкобелков p16/Ki67, иммуноцитохимия (дозаказ к услуге C024)

Исследуемый биоматериал Цервикальный соскоб жидкостный
Cрок исполнения с момента поступления биоматериала в лабораторию 11 к.д.

Папилломавирусная инфекция — одна из самых распространенных инфекций. По разным данным, вирусом папилломы человека (ВПЧ) инфицировано 50-70% населения. Основной путь передачи — половой.
Все типы вируса папилломы человека подразделяют на группы высокого, среднего и низкого онкогенного риска.
Наиболее опасна группа ВПЧ высокого онкогенного риска: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 типы. ВПЧ высокого онкогенного риска вызывает диспластические изменения в клетках эпителия шейки матки, которые в дальнейшем могут переходить в рак шейки матки.
При этом с ВПЧ 16 и 18, а также 45 типа связывают 70% случаев рака шейки матки.

Следует иметь в виду, что организм способен самостоятельно элиминировать ВПЧ в течение 6-12 месяцев — такая картина наблюдается в 80-90% случаев. Элиминация вируса происходит при достаточно высоком уровне иммунитета.
Генитальный вирус папилломы человека– это одна из самых широко распространенных инфекций, передающихся половым путем. Длительность инкубационного периода может составлять от нескольких месяцев до 10-ти лет. В большинстве случаев заболевание протекает в скрытой форме без клинических проявлений.

Согласно существующим рекомендациям, обследование шейки матки должно включать не только анализ на выявление ВПЧ. Обязательным мазком является цитологический, то есть мазок, полученный с поверхности шейки матки и из цервикального канала. В настоящее время данное исследование можно провести двумя способами — классический метод и жидкостный. Разница существенная, так как в случае жидкостной цитологии снижаются риски нарушения забора материала, ошибки подготовительного этапа. Более того, в случае наличия изменений, даже не существенных, при наличии ВПЧ рекомендовано дополнительное исследование — определение коэкспрессии белков р16 и Ki67.

Исследование «Коэкспрессия онкобелков р16/Ki67» назначается дополнительно к услуге 031212 «ВПЧ-ПАП-тест жидкостный» и помогает установить повышенный риск наличия диспластических изменений и рака шейки матки. Определение коэкспрессии p16 и Ki-67 является одним из важных критериев для дифференциального диагноза дисплазии умеренной и высокой степени тяжести и начальных форм рака шейки матки.
Положительный результат исследования «Коэкспресия онкобелков p16/Ki67» является показанием для более тщательного обследования женщины на наличие предраковых поражений шейки матки с помощью кольпоскопического и гистологического исследований.

Белок р 16 является естественным ограничителем деления клеток. Иными словами, данный белок вырабатывается для того, чтобы остановить деление клетки в физиологическом цикле. Влияние белка на механизм деления клеток весьма сложный, но конечный результат зависит от уровня данного белка. Именно он тормозит пролиферацию, вырабатываясь клеткой на ее поверхность.

Антиген Ki 67 также встречается в нормальной клетке и оказывает обратное онкобелку р16 действие, а именно стимулирует деление клеток. Данный механизм также физиологичен, поэтому только обнаружение данного белка не может рассматриваться как абсолютный критерий. Именно поэтому имеет смысл оценивать наличие обоих онкобелков, так как только в случае бесконтрольного деления клеток возможно одновременное их присутствие. Обычно именно при неоплазиях (дисплазиях, раке) отмечается такое хаотичное образование новых клеток, нетипичного строения.

В ходе проведенных исследований стала очевидна связь между появлением онкобелков и прогнозами имеющегося заболевания, а именно женщины с выявленной коэкспрессией должны быть более тщательно обследованы. Так, даже при легкой дисплазии должен быть решен вопрос о необходимости гистологического исследования. Н-SIL в таких случаях однозначно требует проведения конизации, более того, гистологическое исследование может быть пересмотрено дважды.

  • Наличие ВПЧ любых типов, кроме 16,18 и 45 + наличие незначительных изменений при проведении ПАП-теста (например, реактивные изменения, клетки неясного значения).
  • Наличие ВПЧ 16,18, 45 типа при нормальном ПАП-тесте.
  • При наличии выраженных изменения ПАП-теста, даже в случаях отсутствия ВПЧ.

Важно!
Все вышеперечисленные показания могут быть определены в ходе ежегодного обследования шейки матки, которое подразумевает проведение ПАП-теста, ВПЧ-скрининга. Если ПАП-тест был выполнен методом жидкостной цитологии, то исследование на определение онкобелков может быть дополнительным к ранее заказанному ПАП-тесту. Дозаказ возможно сделать в течение 30 дней.

  • Отсутствие коэкспрессии является нормой.
  • Присутствие обоих онкобелков является прогностически неблагоприятным фактором прогрессирования изменений эпителия шейки матки, в частности повышается риск развития изменений высокой степени, рака.

Результаты лабораторных исследований не являются единственным критерием, учитываемым лечащим врачом при постановке диагноза и назначении соответствующего лечения, и должны рассматриваться в комплексе с данными анамнеза и результатами других возможных обследований, включая инструментальные методы диагностики.
В медицинской компании «LabQuest» Вы можете получить персональную консультацию врача службы «Doctor Q» по результатам исследований во время приема или по телефону.

Коэкспрессия онкобелков p16/Ki67

Заказать Коэкспрессия онкобелков p16/Ki67

Тест «Коэкспрессия онкобелков р16/Ki67» назначается дополнительно к услуге 031212 «ВПЧ-ПАП-тест жидкостный» и позволяет выявить женщин, у которых высокая вероятность обнаружения предраковых изменений и рака шейки матки.

Рак шейки матки занимает второе место по частоте среди злокачественных новообразований репродуктивной системы у женщин после рака молочной железы. Доказана роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии рака шейки матки. Важно вовремя выявить предраковые изменения шейки матки и предотвратить переход их в рак! Каждая женщина после начала половой жизни ежегодно должна проходить обследование у гинеколога, а для выявления предраковых изменений шейки матки 1 раз в 3-5 лет! В последнее время в акушерско-гинекологическую практику для раннего выявления предраковых изменений шейки матки, наряду с определением ВПЧ и цитологических мазков, активно внедряется определение белков р16 и Ki-67. Одновременная секреция их (коэкспрессия) свидетельствует о нарушении регуляции клеточного цикла и об онкологических изменениях эпителия шейки матки, вызванных вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска.

Показаниями для назначения услуги 031216 «Коэкспрессия онкобелков p16/Ki67» в лаборатории CMD являются следующие результаты услуги 031212 «ВПЧ-ПАП-тест жидкостный»:

  • ВПЧ-тест – положительный(≥3 lg) (выявлен любой тип ВПЧ), ПАП-тест –ASCUS/ASC-H/L-SIL/H-SIL
  • ВПЧ-тест – выявлены 16/18/45 типы (≥3 lg), ПАП-тест – NILM (норма)
  • ВПЧ-тест – отрицательный (не выявлен ВПЧ), ПАП-тест ≥ H-SIL (CIN2/3).

Положительный результат исследования «Коэкспресия онкобелков p16/Ki67» является показанием для более тщательного обследования женщины на наличие предраковых поражений шейки матки с помощью кольпоскопического и гистологического исследования.

Внимание! Тест «Коэкспрессия онкобелков p16/Ki67» можно дозаказать к услуге 031212 «ВПЧ-ПАП-тест жидкостный» в течение 30 календарных дней от даты регистрации услуги 031212. Необходимо обязательно указать номер пробы, под которым образец проходил в CMD.

Ссылка на основную публикацию
ЭКО в естественном цикле — оплодотворение без стимуляции
ЭКО в естественном цикле Рождение первого ребенка после ЭКО стало возможным, благодаря проведенной процедуре ЭКО в естественном цикле. С 1978...
Шишка за ухом причины появления, разновидности, лечение, фото
Появление шишки за ухом у взрослого Многих пациентов заставляет нервничать такая мелочь как шишка за ухом – вскочившее уплотнение у...
Шишка за ухом у ребенка что это, причины появления, что делать
Шишка за ухом: что делать? Уплотнение около ушной раковины появляется внезапно как у детей, так и у взрослых. Оно постепенно...
ЭКО, стволовые клетки и опухоль мозга Заворотнюк
Опасные союзники: стволовые клетки могут запустить развитие опухоли Сейчас стволовые клетки в России разрешено применять для лечения некоторых заболеваний. Запрет...
Adblock detector